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Comité Editorial Editorial Board
Comité Científico Scientific Committee
EFECTO DIFERENCIAL DEL ALOXANO A CORTO Y A LARGO PLAZO EN TESTÍCULOS DE DOS LÍNEAS DE RATAS
Silvia Mariela V. Vazquez, Noriyuki Hisano
Cátedra de Histología y Embriología. Facultad de Ciencias Médicas Universidad Nacional de Rosario. Santa Fe. Rosario. Argentina
norihisano @ yahoo.com.ar
Rev Electron Biomed / Electron J Biomed 2011;1:38-45.
Comentario del revisor Prof. Gloria Cónsole PhD.
Profesora Titular, Cátedra B de Citología, Histología y Embriología. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de La Plata, Argentina.
Comentario del revisor Prof. Aldo R. Eynard PhD.
Catedrático de Biología Celular, Histología y Embriología. Universidad Nacional de Córdoba, Argentina
RESUMEN:
El aloxano se comporta como una droga tóxica sobre las células beta pancreáticas y, por ende, produce diabetes experimental. Sin embargo, sus potenciales efectos tóxicos a corto y largo plazo sobre otros órganos no han sido ampliamente indagados aún. En consecuencia, este trabajo estudia su acción diferencial en uno y otro caso sobre un órgano de alta tasa reproductiva, como el testículo, en dos líneas de ratas. Para ello, fueron empleadas ratas macho "m" y Sprague-Dawley inyectadas en el peritoneo con aloxano (24 mg/100 mg peso corporal), durante el post-destete inmediato, y sus respectivos controles. A los 31 días y 105 días de edad, los testículos fueron extraídos, disecados, pesados y procesados para microscopía óptica.
Los cortes histológicos se colorearon con Hematoxilina-Eosina. Los pesos testiculares en las ratas "m" aloxanizadas de 31 y 105 días fueron significativamente menores que sus controles. En ambas edades, estas ratas revelaron histológicamente células aumentadas de tamaño, cariorrexis y cariólisis así como amplios espacios intercelulares respecto de sus controles. Por otro lado, los pesos testiculares en las ratas Sprague-Dawley, tratadas con aloxano, no revelaron a los 31 y 105 días diferencias significativas con los controles, excediendo una tendencia descendente en las aloxanizadas. A tales edades, estos animales evidenciaron, picnosis y signos de apoptosis cuando se los comparó con sus controles. Estos resultados, más notorios en las ratas "m", las sindicarían como más sensibles al aloxano. Los efectos tóxicos a corto plazo podrían interpretarse como consecuencias directa del aloxano mientras que los de largo plazo podrían atribuirse a la hiperglucemia de la diabetes experimental actuando sobre un testículo ya sensibilizado por la antedicha acción tóxica directa
PALABRAS CLAVE: Diabetes. Efecto tóxico. Murino. Células germinales.
SUMMARY:
Alloxan acts as a toxic drug on pancreatic beta cells, producing experimental diabetes. Exceeding it, its potential short -and long- term toxic effects on other organs have not been widely investigated yet. Consequently, this paper analyzes it in the testicles of two lines of rats. In this regard, "m" and Sprague-Dawley male rats, intraperitoneally injected with alloxan (24 mg/100 mg peso corporal) during the immediate post-weaning period, and its respective controls. At 31 and 105 days of age, testicles were removed, dissected, weighed and routinely processed for optic microscopy. Histological slices were stained with Hematoxylin-Eosin.
Testicular weights in alloxanized "m" rats were significantly lower than those of controls at both studied ages, revealing simultaneously cells with higher size, karyorrhexis and karyolysis as well as wide intercellular spaces. When compared with controls. On the other hand and exceeding a decreasing trend in alloxanized rats, testicular weights in these group of Sprague-Dawley animals did not show significant differences with controls at 31 and 105 days of age. These animals also evidenced picnosis and signs of apoptosis in relation with controls at both ages. These results, more conspicuous in "m" rats, could be pointing out that these rats would be more sensible to alloxan. The short-term effects could be a direct consequence of the toxic action of alloxan whilst long-term ones could be attributed to hyperglycaemia resulting from experimental diabetes acting on an already sensitized testicle by that direct action.
KEYWORDS: Diabetes. Toxic effect. Murine. Germ cells.
INTRODUCCIÓN
Para el estudio experimental de la Diabetes Mellitus (DM) han sido propuestos modelos animales experimentales a los que se les han destruido las células pancreáticas ß mediante tóxicos como la estreptozotocina o el aloxano, ambas generadoras de hiperglucemia. Sin embargo, han sido descriptas diferencias entre la acción de ambas drogas sobre las aludidas células1-4.
Howland y Zebrowski sugirieron que el aloxano tendría algún fenómeno tóxico extra-pancreático5. En tal sentido, fueron descritas lesiones en riñón e hígado a corto plazo6-8. Complementariamente, han sido reportadas variaciones en la insulina plasmática, la glucemia y los ácidos grasos 2 minutos después de inyectado el aloxano9.
Como se adelantara, el aloxano, inyectado en animales de laboratorio, genera DM por destrucción selectiva de las células ß del páncreas endocrino debido a la producción de radicales libres, designados en su mayoría especies de oxígeno reactivo (Reactive Oxygen Species). A la vez, afecta la actividad de la glucoquinasa10, disminuye la concentración del transportador de la glucosa (GLUT2) y del mRNA de la glucoquinasa 2, con acción a nivel nuclear (DNA)11 y/o mitocondrial12.
En un territorio extra-pancreático como el testículo, en ratas adultas, el aloxano provocó cambios en la cito-arquitectura testicular13, reducción del contaje de espermatozoides y morfología espermática14 e inhibición en los niveles de las gonadotrofinas FSH y LH15,16.
Dado que lo referido sugiere efectos tóxicos del aloxano sobre otros sectores de la economía, cuyo análisis amplio y sistemático escasea en la bibliografía especializada, y, que a pesar de ello, persiste su empleo como inductor de DM en animales de experimentación con fines investigativos, algunos específicamente ligados con el aparato reproductor masculino17, hemos focalizado este trabajo en su efecto diferencial, a corto y a largo plazo, en testículos de dos líneas de ratas pues vislumbramos la importancia de insistir en ello al no excluir la posibilidad de que su simultáneo efecto tóxico intra y extra-pancreático podría producir concomitancias indeseables en los resultados comunicados
MATERIAL Y METODOS
Animales y diseño experimental
Ratas de la línea "m", desarrollada en la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Rosario (UNR)18, y ratas Sprague - Dawley (S-D) provistas por el Bioterio Central de la Facultad de Ciencias Médicas de la UNR, fueron inyectadas en el post-destete inmediato con una dosis única intraperitoneal de aloxano (24 mg/100 g de peso corporal) o con solución fisiológica (1cc/100 g. de peso corporal) (controles).
A las 48 hs se registró la glucemia mediante cintas reactivas Accu-Chek (Roche®). Se consideró efecto positivo del aloxano cuando la glucemia superó los 300mg/100cc.
Las ratas machos se separaron en cuatro grupos que fueron inyectados con aloxano o solución fisiológica en el post-destete inmediato:
1.- "m" aloxano (n=9)
2.- "m" control (n=9)
3.- S-D aloxano (n=10)
4.- S-D control (n=9)
Todos los procedimientos experimentales de este estudio fueron previamente aprobados por la Comisión de Bioética de nuestra escuela médica, asegurando la pertinente adhesión a los estándares fijados por al Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
Análisis estadístico
Los resultados fueron expresados en promedio ± SEM. Para la determinación de diferencias estadísticas entre muestras se empleó el test "t" de Student.
RESULTADOS
1. Pesos corporal y testicular
Los pesos corporal y testicular de los animales "m" aloxano de 31 días de edad fueron significativamente menores (P<0.01) en los animales inyectados con aloxano respecto de sus controles. En las ratas S-D, los pesos corporales mostraron diferencias significativas, pero los testículos mostraron una tendencia al descenso (Gráficos 1 y 2).
Los pesos corporales de los animales "m" y S-D de 105 días de edad fueron significativamente menores (P<0.001) en los animales inyectados con aloxano, en relación con sus controles (Grafico 3). Los pesos testiculares de los animales "m" fueron significativamente menores (P<0.05) en los animales inyectados con aloxano, en comparación con sus contrapartes testigos. En cambio, en el grupo S-D, los pesos testiculares no revelaron diferencias significativas al margen de una tendencia descendente en las aloxanizadas (Gráfico 4).
2. Manifestaciones histológicas
La línea "m" con aloxano presentó, a los 31 días de vida, una capa de espermatogonias adosada a la membrana basal y separada de los espermatocitos del compartimiento adluminal del epitelio seminífero. Se detectaron células en cariorrexis y cariólisis, notorios espacios intercelulares y aumento del tamaño celular (Fig. 1). Sus respectivos controles presentaron túbulos seminíferos de aspecto normal (Fig. 2).
A los 31 días de edad, las ratas S-D aloxanizadas evidenciaron una masa celular intraluminal con intensa picnosis y algunos signos de apoptosis (Fig. 3), mientras que el grupo control mostró una histología del epitelio seminífero con desarrollo normal y acorde a la edad (Fig. 4).
Por su parte, a los 105 días, los animales "m" inyectados con aloxano revelaron pérdida de la arquitectura epitelial, con amplios espacios intercelulares entre las células germinales, masas celulares intraluminales e imágenes compatibles con apoptosis (Fig 5). El grupo control "m" mostró túbulos seminíferos conservados (Fig 6). A la misma edad, las ratas S-D aloxanizadas pusieron en evidencia túbulos seminíferos con bordes irregulares, células germinales con picnosis, perceptibles espacios interepiteliales e imágenes compatibles con apoptosis (Fig 7). El grupo control no se apartó de los diferentes estadios celulares que presenta el epitelio seminífero normal (Fig. 8).
3. Glucemias
Los valores de glucemia en el momento de la autopsia están presentados en la tabla 1 y 2. Se observa, como era dable esperar, que los valores de las glucemias de los animales inyectados con aloxano son elevados.
DISCUSIÓN
En la mayoría de los trabajos reportados como efecto a largo plazo del aloxano se refieren como modificaciones diabéticas realizados en animales adultos13. Nos pareció interesante comparar los hallazgos a largo plazo con los efectos del aloxano a corto plazo.
Coincidiendo con Ulbrich y Palmer19, quienes establecieron que el peso de los órganos y la histopatología son los mejores medios para medir la fertilidad masculina, centramos nuestro estudio en una línea autóctona ("m")18 y en otra, internacionalmente reconocida: la Sprague - Dawley en el corto y en el largo plazo (31 y 105 días, respectivamente).
Nuestros resultados vinculados con los pesos corporal y testicular en ambas líneas pusieron de relieve coincidencias y diferencias con otros autores. La histología testicular mostró algunas diferencias en las ratas "m" de 31 días de edad, llegándose a una clara destrucción tubular seminífera los 105 días de edad, fenómeno similar al descripto por Cai20 en ratas adultas S-D, a los seis meses de haber sido inyectadas con estreptozotocina.
Por su parte, en el grupo S-D los efectos morfológicos en el corto plazo no fueron tan evidentes a la semana de la inyección del aloxano, mientras que los de largo plazo coincidieron con lo reportado previamente por otros autores. Relacionando los resultados obtenidos en "m" y en S-D, los de "m" fueron más llamativos y podrían estar indicando una mayor susceptibilidad al efecto del aloxano. Esto se hallaría avalado por lo aquéllos ligados a la histología de una y otra línea.
Estos hallazgos morfológicos en el corto plazo, particularmente en "m", podrían interpretarse como efectos tóxicos extra-pancreáticos directos. Los efectos en el largo plazo podrían atribuirse a la hiperglucemia, actuando sobre un órgano previamente sensibilizado por acción tóxica directa.
La posibilidad planteada de que los fenómenos tempranos sean consecuencia de un efecto directo del aloxano, coincide con otro modelo experimental como la ingesta de etanol en ratas preñadas trasuntado en daño testicular prepuberal21. Asimismo, el adjudicar las lesiones observadas en el largo plazo posiblemente al efecto conjunto de la toxicidad directa temprana y la ulterior hiperglucemia, se halla avalado por el mejoramiento experimentado en aquéllas tras la administración de insulina22.
Concluyendo, podríamos inferir que: (1) La línea "m" mostró, con mayor claridad y a corto plazo, los efectos del aloxano sobre el testículo; (2) Los cambios estructurales testiculares observados, a corto plazo, tras la inyección del aloxano en el post-destete, sugerirían un fenómeno tóxico directo sobre un territorio extra-pancreático, y (3) Los fenómenos a largo plazo evidenciaron mayor precocidad en la línea "m" que en S-D.
En síntesis, estimamos que la línea "m" resultaría un modelo más adecuado para el estudio del efecto del aloxano no sólo sobre el testículo sino sobre otros sectores orgánicos extra-pancreáticos. Esto último retoma una conjetura que fuera guía para este trabajo y que nuestros resultados renuevan: No inquiramos qué puede hacer el aloxano por la DM sino qué resultados puede obstaculizar o distorsionar a dicho respecto, dado su efecto tóxico extra-pancreático en el corto plazo sobre órganos que interactúan en la determinación de tal enfermedad. De allí la necesidad que percibimos acerca de profundizar el estudio de la toxicidad aloxánica en distintos sistemas, muy especialmente en aquéllos que interaccionan y coadyuvan en la génesis, perdurabilidad y complicaciones de la DM.
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AGRADECIMIENTOS:
A la Dra. Roxana Lattante, docente de la Cátedra de Anatomía Patológica de la Facultad de Ciencias Médicas, por su asesoramiento y a la Srta. Agostina Tardivo por su aporte en la confección de los gráficos.
CORRESPONDENCIA:
Noriyuki Hisano
Cátedra de Histología y Embriología
Facultad de Ciencias Médicas
Universidad Nacional de Rosario
Santa Fe 3100
2000 Rosario
ARGENTINA
Email: norihisano @ yahoo.com.ar